امکان استفاده از سلولهای بنیادی پرتوان برای بازگرداندن اپیتلیوم رنگدانه آسیب دیده شبکیه چشم

اپیتلیوم رنگدانه شبکیه یک لایه مونو از سلولهای شش ضلعی رنگدانه است که توسط تماس های متراکم متصل می شوند. این سلولها بخشی از سد خارجی بین خون و شبکیه را تشکیل می دهند ، از چشم در برابر نور بیش از حد محافظت می کنند ، عملکردهای ترشحی مهمی دارند و همچنین از کار گیرنده های گیرنده پشتیبانی می کنند و از هماهنگی بسیاری از مکانیسم های نظارتی اطمینان می دهند. این انحطاط اپیتلیوم رنگدانه است که علت اصلی بسیاری از بیماریهای دژنراتیو شبکیه است. جستجوی منابع قابل اعتماد از منابع سلولی برای پیوند اپیتلیوم رنگدانه شبکیه یک کار بسیار فوری است. سلولهای بنیادی پوتول (ساقه جنینی یا پرتوان ناشی از آن) می توانند با راندمان بالا به اپیتلیوم رنگدانه شبکیه متمایز شوند ، که فرصت هایی را برای سلول درمانی در حین تخریب شبکیه باز می کند و می تواند به شما امکان کاهش سرعت توسعه آسیب شناسی را بدهد و حتی ، یعنی بازگشت دید خود به بیمار امکان پذیر است. کار پیشگام در پیوند اپیتلیوم رنگدانه شبکیه که از سلولهای بنیادی پرتوان انجام شده در ایالات متحده و ژاپن متمایز شده است ، نیاز به توسعه و بهینه سازی چنین رویکردهایی را برای سلول درمانی تأیید می کند. برای استفاده مؤثر از سلولهای اپیتلیوم رنگی ، که از سلولهای بنیادی پرتوان متمایز شده است ، مجموعه ای از خصوصیات عملکردی که مشخصه سلول های اپیتلیوم رنگدانه در داخل بدن است. این بررسی به طور خلاصه وضعیت فعلی مطالعات بالینی و بالینی در زمینه جایگزینی درمانی اپیتلیوم رنگدانه شبکیه را خلاصه می کند. بر اساس داده های خود و منتشر شده ، پروتکل های تمایز متفاوتی با هم مقایسه شدند ، مشکلات پزشکی که در راه استفاده گسترده از اپیتلیوم رنگدانه شبکیه متمایز از سلولهای بنیادی پرتوان است.

کلید واژه ها

متن کامل

ВВЕДЕНИЕ Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) образован монослоем гексагональных эпителиальных клеток с большим числом меланосом, содержащих пигмент меланин (рис. 1). Базальной мембраной для пигментного эпителия служит внутренний слой пятислойной мембраны Бруха. Ядра у клеток ПЭС размещены ближе к базальному полюсу, содержащему меньше меланосом. На апикальном полюсе ПЭС расположено множество меланосом и микроворсинок (ресничек), которые «укутывают» наружные сегменты фоторецепторных клеток. Различают длинные и короткие микроворсинки. Короткие микроворсинки соединяются с концами наружных сегментов фоторецепторов, а длинные расположены между внешними сегментами [1]. В области макулы каждая клетка ПЭС имеет контакты с 20-55 фоторецепторами [2]. Пространство между микроворсинками ПЭС и внешними сегментами фоторецепторов наполнено матриксом, который вместе с микроворсинками обеспечивает плотное прилегание сетчатки к ПЭС. Функции ПЭС: Поглощение света. Меланосомы ПЭС обеспечивают поглощение большей части света, не абсорбированного фоторецепторами. Поглощение света препятствует отражению и рассеиванию света по сетчатке, что позволяет сохранить контрастность и четкость изображения. Под действием света меланосомы мигрируют на апикальную сторону клеток, в микроворсинки, которые окружают внешние световоспринимающие сегменты фоторецепторов. В темноте меланосомы возвращаются обратно в центральную часть клетки при участии микрофиламентов и гормона меланотропина. Функцию поглощения света обеспечивают главным образом длинные микроворсинки [3]. Кроме того, ПЭС помогает рассеивать тепло в сетчатке, которое выделяется при поглощении света и в результате процесса зрительной фототрансдукции [2]. Фагоцитоз. Клетки ПЭС осуществляют фагоцитоз отработанных дисков фоторецепторов [5]. Каждая клетка ПЭС ежесуточно фагоцитирует 2-4 тысячи отработанных дисков [6]. Осуществление зрительного цикла. Диски наружных сегментов фоторецепторов содержат большие белки опсины и отвечают за поглощение света. Опсин синтезируется во внутренних сегментах и транспортируется в наружные сегменты. Для осуществления зрительного цикла необходим родопсин. Он состоит из опсина, соединенного с 11-цис-ретиналем. При поглощении света ретиналь изомеризуется из 11-цисретиналя в транс-ретиналь, а затем превращается в транс-ретинол. В ходе зрительного цикла фоторецепторы не могут превратить транс-ретинол обратно в 11-цис-ретиналь, поэтому он транспортируется в ПЭС для реизомеризации, а затем возвращается в фоторецепторы [1]. Барьерная функция. Обеспечение выборочной поставки необходимых питательных веществ фоторецепторам от сосудистой оболочки и отвод продуктов распада в обратном направлении. ПЭС является второй частью гематоретинального барьера, который препятствует попаданию в сетчатку из хориокапилляров больших молекул. Первая часть этого барьера - эндотелий капилляров сетчатки [3, 5, 6]. Секреция гормонов и факторов роста. Клетки ПЭС поляризованы и секретируют различные цитокины и факторы роста в разных направлениях, что очень важно для функционирования хориокапилляров и сетчатки. Например, VEGF, который секретируется с базальной стороны клеток ПЭС, жизненно необходим хориокапиллярам, а PEDF и TGF-β, которые секретируются в основном апикальной стороной клеток ПЭС, необходимы в субретинальном пространстве [1, 2]. Несомненно, ПЭС играет важнейшую роль в обеспечении жизнедеятельности фоторецепторов, и правильное функционирование фоторецепторов возможно лишь при здоровом ПЭС. ЗАБОЛЕВАНИЯ, СВЯЗАННЫЕ С ДЕГЕНЕРАЦИЕЙ ПЭС Самыми распространенными заболеваниями, при которых происходит дегенерация ПЭС, являются возрастная макулярная дегенерация (ВМД) сетчатки и пигментный ретинит (ПР) [6, 7]. Эти две болезни считаются главными причинами слепоты в западных странах. На сегодняшний день не существует удовлетворительных способов борьбы с ними, так как сетчатка и ПЭС не регенерируют, и только в случае влажной формы ВМД с помощью антиVEGF-терапии можно замедлить развитие болезни [8]. ВМД - это многофакторное заболевание, на формирование которого оказывают влияние генетические факторы, старение, образ жизни (курение, индекс массы тела, диеты) [1]. ВМД подразделяют на сухую и влажную формы. При сухой форме ВМД небольшие аморфные отложения, содержащие жиры и белки, известные как друзы, скапливаются под макулой между внутренним слоем мембраны Бруха и базальной мембраной ПЭС [9]. Это приводит к местному воспалению, вызванным окислительным стрессом [1]. Со временем теряется взаимодействие между ПЭС и фоторецепторами, и в результате снижается центральное зрение. Эта форма ВМД встречается чаще всего и возникает примерно у 90% людей с данным заболеванием. При влажной форме ВМД новые кровеносные сосуды появляются в тех участках макулы, где их не должно быть. Это вызывает разрушение структуры макулы, что приводит к скоротечной потере центрального зрения. Хотя этот вид ВМД встречается приблизительно у 10% людей с данным заболеванием, на его долю приходится 90% случаев серьезного снижения зрения, связанного с ВМД. Пигментный ретинит (ПР) - основная причина слепоты среди детей и подростков. Распространенность ПР составляет 1 случай на 3500 человек [8, 10]. Это наследственное заболевание часто приводит к слепоте, оно характеризуется прогрессирующей дисфункцией и гибелью палочек. В некоторых случаях ПР сопровождается повреждением ПЭС. Описано около 50 генов, мутации в которых вызывают ПР. Среди них гены белков, связанных с передачей светового сигнала, ретиноидным циклом, клеточной адгезией, цитоскелетом [10]. Наиболее распространенный тип ПР вызван мутациями в гене, кодирующем опсин [11]. На ранних стадиях ПР происходит дегенерация палочек, при этом пациенты теряют ночное и периферическое зрение. На поздних стадиях ПР у них развивается туннельный синдром, а также начинают гибнуть колбочки, приводя к серьезным проблемам [1]. Болезни Штаргардта и Беста - формы наследуемой ювенильной дегенерации макулы, распространены меньше, чем ПР и ВМД. Макулодистрофия Штаргардта вызывается мутациями гена ABCA4, что приводит к накоплению в клетках ПЭС N-ретинилиден-N-ретинилэтаноламина (di-retinoidpyridinium ethanolamine, A2E) и его модификаций. Эти токсины вызывают гибель пигментного эпителия и последующую гибель фоторецепторов макулы сетчатки, сопровождающуюся потерей центрального зрения [12, 13]. На данный момент нет способов остановить потерю зрения при макулодистрофии Штаргардта [14]. Существует еще целый ряд так называемых «заболеваний, подобных болезни Штаргардта» (Stargardt’s-like diseases), обусловленных мутациями в генах CNGB3, ELOVL4, PROM1 [14, 15]. Болезнь Беста - аутосомно-доминантное наследственное заболевание, обусловленное мутациями в гене BEST1, кодирующем трансмембранный белок bestrophin-1 (бестрофин-1). Этот белок входит в состав базолатеральной плазматической мембраны ПЭС, но его функция ясна не до конца. Известно, что при болезни Беста изменяется транспорт хлорид-ионов, нарушен перенос жидкости через ПЭС, накопление метаболитов (например, липофусцина) и жидкости между мембраной Бруха и комплексом ПЭС/фоторецепторы. Следствием этих процессов является гибель фоторецепторов и потеря центрального зрения [1, 12]. Болезнь Беста была первой среди заболеваний сетчатки, клеточную модель которой создали с помощью пациент-специфичных ИПСК. С помощью этой модели на молекулярном уровне показано, что в мутантном ПЭС нарушена переработка внешних сегментов фоторецепторов, замедлен цикл превращений родопсина [16]. ПЕРСПЕКТИВЫ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СЕТЧАТКИ ГЛАЗА Существуют различные стратегии использования аутологичного и аллогенного материала для трансплантации пациентам с ВМД [6] и другими заболеваниями, связанными с дегенеративными процессами в сетчатке. Для клинических испытаний с использованием аутологичного материала используют три основные стратегии: транслокацию макулы (например, [17]), аутотрансплантацию лоскута ПЭС-хороид (например, [18]) и субретинальную инъекцию суспензии аутологичных клеток ПЭС (например, [19]). Меорс с соавт. (Meurs et al.) описан опыт аутотрансплантации периферического ПЭС семи пациентам с ВМД. Постоперационное наблюдение в течение года не выявило значимых улучшений остроты зрения, хотя три пациента положительно оценивали свое состояние. Два пациента сообщили об ухудшении зрения, что, по мнению авторов, могло быть связано с постоперационным отслоением сетчатки и пролиферативной витреоретинопатией [20]. В работе Фалкнер-Рэдлер с соавт. (Falkner-Radler et al.) сравнивали эффективность аутотрансплантации лоскута ПЭС-хороид и субретинальной инъекции суспензии ПЭС в двух группах пациентов по семь человек каждая. По результатам 24-месячного наблюдения за пациентами обеих групп не обнаружено статистически значимых различий в тесте максимально корригированной остроты зрения (МКОЗ). Однако индивидуальные результаты в группах оказались неоднозначными. Так, и в первой, и второй группе зафиксировано как улучшение зрительной функции у отдельных пациентов, так и ухудшение остроты зрения [21]. В 2012 году Ван Зибург с соавт. (van Zeeburg et al.) сообщили о способности трансплантированного лоскута ПЭС-хороид поддерживать функцию макулы на протяжении длительного периода наблюдения с относительно низким уровнем осложнений и рецидивов. Эта работа основана на 7-летнем постоперационным наблюдением за 130 пациентами, у которых с 2001 по 2006 год были проведены операции по аутотрансплантации лоскута ПЭС-хороид (всего 133 глаза) [22]. Это исследование и его основные выводы критиковали в своем обзоре Сэйлер и Арамант (Seiler and Aramant, 2012), указавшие на отсутствие контрольной группы и на незначительное количество глаз, которые действительно наблюдали после операции (9 глаз на 7-й год наблюдения) [23]. Таким образом, вопрос об эффективности и стабильности результата аутотрансплантации ПЭС остается дискуссионным. Несомненное преимущество метода состоит в отсутствии проблем гистосовместимости и необходимости иммуносупрессивной терапии. С другой стороны, аутотрансплантация не всегда приводит к предсказуемым результатам [24]. Не исключено, что клетки, пересаживаемые с незатронутого дегенерацией участка, уже имеют скрытые морфофункциональные изменения. Кроме того, трудность получения материала для аутотрансплантации со здоровых участков ограничивает возможности лечения на поздних стадиях заболевания. Другим источником клеток для трансплантации ПЭС пациентам с макулодистрофией может быть донорская ткань с учетом гистосовместимости донор-реципиент. Как правило, пересаживают фетальный материал, хотя существуют сообщения о пересадке аллогенной ткани взрослых доноров. Впервые аллогенный фетальный материал для пересадки ПЭС был использован в 1999 году при лечении 16 пациентов [25]. Иммуносупрессивную терапию в послеоперационный период тогда не использовали, и у 75% пациентов наблюдалось медленное отторжение трансплантированной ткани. Первое сообщение о пересадке ПЭС от взрослого донора вышло в 2001 году [26]. Эта операция была проведена 85-летней пациентке, которая скончалась спустя 4 месяца после процедуры. Сама операция к улучшению показателей зрения не привела. Таким образом, первые клинические трансплантации ПЭС с использованием аллогенных донорских тканей оказались достаточно неудачными. Первые внушающие оптимизм аллогенные трансплантации были проведены американским хирургом Норманом Радтке (Norman D. Radtke). В 2004 году им опубликовано сообщение о трансплантации комплекса фетальной нейроретины/ПЭС 64-летней женщине с пигментной дистрофией сетчатки (ПДС) [27]. Эта операция привела к улучшению остроты зрения у пациентки при 5-летнем наблюдении. Далее в 2008 году такая же операция тем же хирургом была проведена 10 пациентам с ПДС, и у семи привела к улучшению остроты зрения. При этом у одного из пациентов в послеоперационный период острота зрения не изменилась, а у двух зрение ухудшилось [28]. В 2007 году другой группой хирургов-офтальмологов была проведена пересадка аллогенной ткани ПЭС взрослого человека 12 пациентам с экссудативной макулодистрофией. Пациенты проходили курс иммуносупрессивной терапии длительностью до 6 месяцев. Постоперационное наблюдение в течение первого года показало улучшение остроты зрения, чтения и других параметров зрительной функции, хотя статистические методы этих различий не подтвердили [24]. Таким образом, несмотря на первоначально заявленную перспективность, результаты трансплантации аутологичной или донорской ткани при ВМД оказались противоречивыми. При аутотрансплантации есть риск, связанный с хирургическим вмешательством, предполагающим получение здоровой ткани в незатронутом процессами дегенерации участке сетчатки и дальнейшие манипуляции, связанные с внедрением аутотрансплантата в область макулы [29]. К тому же существует возможность продолжения деградации аутотрансплантированной здоровой ткани. Аллогенная трансплантация неизбежно сопровождается проблемами с получением донорского материала, гистосовместимостью донор-реципиент и необходимостью иммуносупрессивной терапии, которая, в свою очередь, связана со множеством побочных эффектов. Мы хотели бы специально отметить, что описания экспериментов с пересадкой мезенхимальных стволовых клеток (МСК) для лечения заболеваний глаз находятся за рамками данного обзора. Заметим только, что уже достаточно общепринятым считается, что МСК в этом случае могут оказывать лишь паракринный эффект, так как способностью к дифференцировке вне мезодермального зародышевого листка эти клетки не обладают [30, 31]. В конце XX века из внутренней клеточной массы бластоцист получили культуры эмбриональных стволовых клеток мыши и человека (ЭСК) [32, 33]. В 2006 году создали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) - получаемые путем генетического репрограммирования дифференцированных клеток аналоги ЭСК [34]. ЭСК и ИПСК являются плюрипотентными, т.е. они способны к неограниченному росту и самообновлению, а также к дифференцировке в клетки любых типов. Именно плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) могут стать решением проблемы источника клеток для трансплантации, с которой столкнулись исследователи в рамках клинических испытаний по аутои аллогенной трансплантации ПЭС. В последние годы создано несколько протоколов направленной дифференцировки ЭСК и ИПСК в ПЭС, а некоторые были опробованы в клинических испытаниях [5, 35-39]. Стоит отметить, что анатомо-морфологические особенности глаза (относительно небольшие размеры, парность органа, хорошо разработанные методы диагностики и инструментального мониторинга, возможная иммунная привилегированность и наличие гематоретинального барьера) делают его удобной мишенью для отработки технологии доставки материала при клеточной терапии с использованием производных из плюрипотентных клеток [40]. НАПРАВЛЕННАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ПЭС ИЗ ПСК Направленная дифференцировка ПЭС из ИПСК и дальнейшее применение полученного материала в клинической практике представляют интерес для многих исследователей (например, [11, 41]). Сравниваются различные протоколы дифференцировки, их эффективность и временные затраты. Кратко рассмотрим некоторые протоколы, которые на сегодняшний день нам кажутся наиболее эффективными. Незначительные количества клеток пигментного эпителия сетчатки могут образовываться при спонтанной дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток человека [35]. При удалении из культуральной среды фактора FGF2, необходимого для поддержания плюрипотентного состояния в культуре, плюрипотентные стволовые клетки человека, культивируемые на подложке из эмбриональных фибробластов мыши, матригеле, полилизине или ламинине, способны к образованию клеток пигментного эпителия [35, 42, 43]. Через 10-12 недель спонтанной дифференцировки образуются небольшие пигментированные области, которые затем механически отделяют от остальной массы клеток, получая практически чистую культуру клеток пигментного эпителия (>پاکیزگی 99 ٪). اصلاحات مختلف ترکیب محیط کشت و زمان تمایز باعث افزایش خروجی سلولهای اپیتلیوم رنگدانه می شود [44 ، 45]. با این حال ، برای به دست آوردن محصولات زراعی ، که تا حد زیادی با سلولهای اپیتلیوم رنگدانه شبکیه غنی شده است ، بدون انتخاب مکانیکی زمان مستعمرات رنگدانه ، پروتکل های مؤثر تمایز کارگردانی لازم است. همانطور که کار سالهای اخیر نشان داده است ، از IPSK و ESC می توانید سلولهای آزمایشگاهی اپیتلیوم رنگدانه شبکیه را دریافت کنید ، از نظر مورفولوژیکی و عملکردی با چنین سلولهای داخل بدن مطابقت دارد. بنابراین ، در کار شخصی.(لیچ و همکاران) با مقایسه اثربخشی پروتکل های تمایز خود به خودی و کارگردانی در PES در پنج خط مختلف IPS ، به دست آمده از اهدا کنندگان مختلف و انواع مختلف سلول. نشان داده شده است که توانایی تمایز مؤثر می تواند توسط منبع اولیه سلولهای اهدا کننده ، روش برنامه ریزی مجدد و پروتکل مورد استفاده [46] تحت تأثیر قرار گیرد ، که بار دیگر بر لزوم استاندارد سازی روش برای به دست آوردن PE از PSK برای استفاده بالینی تأکید می کند. یکی از اولین تمایزهای کارگردانی PSC در PES توسط Hirams با Soavt انجام شد.(هیرامی و همکاران) [47]. IPSK موش و مرد در کشت تعلیق با WNT و آنتاگونیست های گره ای تحت درمان قرار گرفتند که این امر به تمایز به اپیتلیوم سن کمک می کرد. از آنجا که سلولهای PEP از Neuro-ethroderma متمایز می شوند و دارای خصوصیات کلی با سلول های مش عصبی در داخل بدن هستند ، یک پروتکل تمایز دو مرحله ای برای به دست آوردن سلولهای اپیتلیال رنگدانه از پیش سازهای عصبی-اپیتلیال تهیه شده است [48-51]. واحدهای ESC در ابتدا در تعلیق در محیطی برای تمایز عصبی کشت می شوند. سپس ، پیشینیان نوروپیتلیال در سلولهای ادعا شده اپیتلیوم رنگدانه افزایش یافته و متمایز شدند و FGF2 را در یک محیط فرهنگی با افزودنی B27 جایگزین کردند. سلولهای اول ، مشابه سلولهای اپیتلیوم شبکیه ، پس از 4 هفته تمایز ظاهر شدند و پس از 8 هفته تعداد سلولهای مناسب برای خرده فروشی معنی دار شد. این روش دو مرحله در مقایسه با روش تمایز خود به خود مؤثرتر است. بر اساس نقش نیکوتین آمید (NIC) در متابولیسم ، بقا ، انعطاف پذیری و تمایز سلول ها ، idelson با سویا.(Idelson و همکاران) تأثیر NIC را در تمایز ESC در سلول های اپیتلیوم رنگدانه مورد مطالعه قرار داد [5]. برای القاء تمایز در سلولهای PES ، خوشه های ESC به دست آمده با استفاده از کلاژناز ،